色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等。

　　在二手液相色譜儀定量分析中，分離開(kāi)是首要要求。基線(xiàn)分離是提供結(jié)果的有效保障。含有5個(gè)組分或更少的樣品，使譜峰之間達(dá)到基線(xiàn)分離一般較為容易。分離度會(huì)隨色譜柱的使用時(shí)間逐步降低，也會(huì)由于分離條件的微小波動(dòng)而在不同時(shí)間有所變化，因此在建立簡(jiǎn)單混合物的分離方法時(shí)，使R≥2。這樣的分離度將有利于改善測(cè)試精度和方法的普適性；含10團(tuán)種或10種以上組分的樣品，分離一般會(huì)很困難，目標(biāo)分離度往往必須降低至R＞1.0—1.5。

　　有些HPLC測(cè)定不必使全部被測(cè)組分達(dá)到基線(xiàn)分離，這種情況常見(jiàn)于所測(cè)樣品中可能存在數(shù)種化合物但僅需檢測(cè)其中的一種時(shí)。比如在普查水或土壤樣品中的某污染物時(shí)，僅需要分離出個(gè)別除莠劑，確定其特征保留時(shí)間進(jìn)行峰鑒別即可。

　　盡管大多數(shù)HPLC設(shè)備能在更高的壓力下工作，使用新色譜柱的工作壓力不應(yīng)超過(guò)170bar，壓力上限在2000psi以下。限制該壓力基于兩點(diǎn)原因：

　　，隨著色譜柱的使用，微粒雜質(zhì)會(huì)逐步堵塞柱頭，使柱壓成倍升高；

　　第二，較低的壓力適于泵、進(jìn)樣閥、尤其是自動(dòng)進(jìn)樣裝置的穩(wěn)定工作，密封墊的壽命更長(zhǎng)，色譜柱堵塞的情況減少，系統(tǒng)的耐久性明顯提高。因此，以小于泵的zui大允許壓力的50%作為目標(biāo)壓力。