色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等。

　　在二手液相色譜儀定量分析中，分離開是首要要求。基線分離是提供結果的有效保障。含有5個組分或更少的樣品，使譜峰之間達到基線分離一般較為容易。分離度會隨色譜柱的使用時間逐步降低，也會由于分離條件的微小波動而在不同時間有所變化，因此在建立簡單混合物的分離方法時，使R≥2。這樣的分離度將有利于改善測試精度和方法的普適性；含10團種或10種以上組分的樣品，分離一般會很困難，目標分離度往往必須降低至R＞1.0—1.5。

　　有些HPLC測定不必使全部被測組分達到基線分離，這種情況常見于所測樣品中可能存在數種化合物但僅需檢測其中的一種時。比如在普查水或土壤樣品中的某污染物時，僅需要分離出個別除莠劑，確定其特征保留時間進行峰鑒別即可。

　　盡管大多數HPLC設備能在更高的壓力下工作，使用新色譜柱的工作壓力不應超過170bar，壓力上限在2000psi以下。限制該壓力基于兩點原因：

　　，隨著色譜柱的使用，微粒雜質會逐步堵塞柱頭，使柱壓成倍升高；

　　第二，較低的壓力適于泵、進樣閥、尤其是自動進樣裝置的穩定工作，密封墊的壽命更長，色譜柱堵塞的情況減少，系統的耐久性明顯提高。因此，以小于泵的zui大允許壓力的50%作為目標壓力。